Sysmex-Partec流式細(xì)胞儀，你不知道的那些事--系列三：植物DNA檢測解析
來源：本站 作者：admin 時間：2019/1/8
【前言】
流式細(xì)胞儀最初的研究就是集中于測量發(fā)育異常的細(xì)胞遺傳物質(zhì)的數(shù)量變化，至今這項(xiàng)技術(shù)仍是植物生物學(xué)中評估基因組的大小和倍性水平參考方法。植物DNA水平的鑒定對植物種質(zhì)資源、物種進(jìn)化、物種分類、生態(tài)學(xué)研究、倍體育種等方面具有重要意義。
【方法原理】
細(xì)胞核在提取液中機(jī)械地從約1cm2 (或20mg) 組織中提取出來，過濾后，細(xì)胞核被包含PI或者DAPI（SysmexPartec）的染色液染色，隨后在流式細(xì)胞儀上檢測。流式細(xì)胞儀需配置一個或者多個綠色（PI）、藍(lán)色（PI）和紫外（DAPI）激發(fā)光源。
圖1 植物倍性分析樣本準(zhǔn)備步驟
【核懸液】
過濾階段可移去組織碎片，然而一些碎片并不能被完全去掉，比如葉綠體、線粒體、可溶性的分類混合物、DNA酶和RNA酶等，這些都會影響分析的質(zhì)量。加入抗氧化劑（亞硫酸鹽、巰基乙醇）、單寧（PVP）、葉綠體裂解液（Triton）、RNA溶解液（RNA酶，冰?。┑瓤梢越档瓦@些物質(zhì)對結(jié)果的干擾。
【參照物】
通常情況下，要選擇與待測樣本基因組大小相近的物種作為參照物。這個參照物需要和樣本一起制備，以降低操作中引入偏差。已知內(nèi)部參照物的DNA的重量（pg）或者堿基對（bp），通過參照物和樣本的峰值準(zhǔn)確計算待測樣本。兩個的換算公式為：
DNA 含量(bp) = 0.978 x 109x DNA 含量 (pg)
【流式分析】
為了清除未過濾掉的細(xì)胞碎片，流式細(xì)胞術(shù)通過SSC vs FL散點(diǎn)圖設(shè)門。
圖2 番茄樣本的倍性分析。
A圖顯示SSCvsFL6(PI發(fā)射)，命名為“Nuclei”的門應(yīng)用與B圖中，B柱形圖顯示“Nuclei”門內(nèi)FL6峰值。
【核內(nèi)復(fù)制評估】
圖2中使用的番茄樣本顯示出核內(nèi)復(fù)制與DNA復(fù)制的相關(guān)性，如有絲分裂，但是沒有區(qū)分核和細(xì)胞自身。核內(nèi)復(fù)制的峰是疊加在經(jīng)典的細(xì)胞周期峰上的：
2C→4C→8C→16C。還可以同時查看所以核分布信息，同時一些巧合也會產(chǎn)生假的峰‘2C + 4C’。
圖3 番茄樣本中的核復(fù)制以及峰值結(jié)果統(tǒng)計
【基因組檢測】
使用流式細(xì)胞儀對DNA準(zhǔn)確地定量分析需要非堿基特異性的、DNA嵌合型染料。主要的嵌合型染料為PI和EB。
圖4 使用已知DNA含量的大蒜作為參照物分析狗尾草的DNA含量
注：PK1 和PK2 分別為作為參照物大蒜的2C和4C的峰值，PK3 為狗尾草的峰值，從而計算出狗尾草DNA含量 = 123.97/49.50 = 2.50。2C 值計算為2.50 x 34.80 = 87.15 pg。
【AT/CG比例】
這個原理是基于DNA嵌合染料的使用相對于基數(shù)重復(fù)的熒光色素。例如，5 x AT Hoechst 33342和3 x GC 光神霉素的AT/GC比例的計算方法：
RIP=待測物熒光強(qiáng)度/參照物熒光強(qiáng)度 PI檢測
RHO=待測物熒光強(qiáng)度/參照物熒光強(qiáng)度 Hoechst 33342檢測
RCA=待測物熒光強(qiáng)度/參照物熒光強(qiáng)度 Chromomycin A3檢測
待測物AT % = 參照物AT% AT (RHO/RIP)1/5和/或 待測物GC% = 參照物GC% (RCA/RIP)1/3
最終得出的：待測物AT % +待測物GC %=100 %
【孤雌生殖和異倍體】
孤雌生殖是一種不經(jīng)過受精但產(chǎn)生種子生殖方式。其繁殖后代與母體是相同的。流式圖中的峰是由于種子的胚胎和胚乳細(xì)胞由無特定的孤雌生殖以及孤雌生殖的方式產(chǎn)生。（圖5）
圖5 使用流式細(xì)胞儀在柱形圖熒光通道里對繁殖方式的研究
對于異倍體，峰的位置會被以下出現(xiàn)的情況影響：油菜籽(Brassica napus)的染色體包含n = 16和n = 19的染色體，因此會產(chǎn)生雙峰。
【細(xì)胞周期】
在生理?xiàng)l件下，細(xì)胞自然呈現(xiàn)不同階段的細(xì)胞周期的DNA圖譜。
【試劑選擇】
對于植物核含量的檢測，主要的試劑為DAPI和PI，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求和儀器配置，可以對染料進(jìn)行選擇。具體區(qū)別羅列如下：
|
|
DAPI |
PI |
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激光光源 |
365nm |
488nm或532nm |
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染色原理 |
只染色DNA |
同時染色DNA和RNA |
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熒光強(qiáng)度 |
強(qiáng) |
弱 |
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熒光分辨率 |
高，CV<1% |
低，CV>3% |
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激光光斑 |
大，對光斑定位依賴小 |
小，對光斑定位依賴大 |
|
染料毒性 |
強(qiáng) |
低 |
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染料粘附性 |
小 |
大 |
|
染色時間 |
短，<2min |
長，>30min |
|
結(jié)果穩(wěn)定性 |
次生代謝對結(jié)果影響小 |
次生代謝對結(jié)果影響大 |
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應(yīng)用 |
倍性分析，細(xì)胞周期 |
倍性分析，基因組大小分析，細(xì)胞周期 |
常用試劑型號
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貨號 |
英文名稱 |
中文名稱 |
測試數(shù) |
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05-5001 |
CyStain® UV Ploidy |
UV倍性分析試劑盒 |
250 tests |
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05-5002 |
CyStain® UV Precise P |
UV精確P倍性分析試劑盒 |
250 tests |
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05-5002-a |
CyStain® UV Precise P "automate" |
UV精確P倍性分析試劑盒—自動 |
2 x 1000 ml |
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05-5003 |
CyStain® UV Precise T |
UV精確T倍性分析試劑盒 |
250 tests |
|
05-5003-a |
CyStain® UV Precise T "automate" |
UV精確T倍性分析試劑盒—自動 |
2 x 1000 ml |
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05-5004 |
CyStain® DNA 1 step |
DNA一步法 |
250 tests |
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05-5005 |
CyStain® DNA 2 step |
DNA二步法 |
250 tests |
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05-5022 |
CyStain® PI Absolute P |
PI精確P倍性分析試劑盒 |
250 tests |
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05-5022-S |
CyStain® PI Absolute P |
PI精確P倍性分析試劑盒(小) |
50 tests |
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05-5023 |
CyStain® PI Absolute T |
PI精確T倍性分析試劑盒 |
250 tests |
